美国提升第三代测序技术准确性SMRT技术的优化提升滚轧机

08-13

2019年8月12日，美国Pacific Biosciences公司在Nature Biotechnology杂志上发表题为Accurate circular consensus long-read sequencing improves variant detection and assembly of a human genome的文章，该文章通过优化CCS测序方法 （Circular Consensus Seuqencing） 以提高SMRT测序（single-molecule real-time sequencing）准确度，并使用优化后的方法对已经被深入研究的人HG002/NA24385基因组进行测序、评估。

SMRT测序技术采用CCS模式测序（图1），在该测序方法下，酶读长通常大于插入片段的长度，因此酶会绕着模版进行滚环式测序，即插入片段会被多次测序，然后再通过算法进行自我纠错得到高准确度的HiFi序列（High fidelity reads）（图1a）。因此，该模式需要平衡测序中所用的酶读长和插入片段的长度。在该研究中，团队首先优化了CCS建库方法，通过测评，为了达到Q30测序质量，最终确定使用15kb长度的接头（在该方法中被称为SMRTbell）和读长为150kb的酶以对插入片段进行10次重复测序（图1b）。基于此，CCS测序最终共产生了89Gb的数据，获得了长度为13.5±1.2kb的序列（图1c）。

图1 CCS测序方法

对结果进行评估，CCS测序的错误率是Illumina NovaSeq的1/17，然而Indel的错误率却是Illumina NovaSeq的181倍。研究人员还将CCS测序结果和NGS结果匹配到人的GRCh37基因组，评估结果显示CCS比NGS测序覆盖度高 （图2） ，能够覆盖到某些NGS难以成功测序的区域，包括许多与疾病相关的基因，还能够解决复杂区域的测序，如HLA1、HLA2基因。

图2 CCS的比对情况

利用GTAK评估SNV和小插入缺失（small-indel,<50bp），SNV的准确度为99.468%，灵敏度为99.559%，插入缺失的准确度为78.988%，灵敏度为81.248%，在插入缺失方面的表现不如NGS。但是由于GTAK的模型是为NGS设计的，所以团队进一步使用了Google 的DeepVariant模型，发现结果显著提高，插入缺失的准确度和灵敏度显明显提升，分别达到97.901%和95.980%。在结构变异方面，与Illumina 2×250bp short reads（使用Manta和Delly软件检测）、10x Genomics linked reads （使用LongRanger软件检测） ，CCS在 （使用pbsv 和Sniffles软件检测） 在准确度和灵敏度上都更优。

另外，还基于FALCON、 Canu和wtdbg算法分别对序列进行了从头组装，结果显示组装质量均较高（表1），且与HG002标准结果高度一致。

图3 基于CCS数据从头组装的结果

虽然目前三代测序的使用不如二代测序那么广泛，但是该测序技术具有连贯性、完整性等优点，适用于微生物基因组从头组装、动植物基因组连续性重构、染色体的结构变异等研究，还能够填补人类参考基因组中存在的序列间隔。该研究提升了第三代测序技术的准确性，对SMRT技术进一步广泛应用有着重要意义。

研究背景

目前，二代测序技术（Next-Generation Sequencing，NGS）已经十分成熟，测序成本低，测序结果精确度高，但是其测序长度通常小于300bp。该测序长度并不是适合从头组装、单倍型定相（haplotype phasing）和结构变异等研究。因此针对测序长度不够的问题，近年来出现了第三代测序技术即单分子测序技术。第三代测序技术原理主要有两类，一类是单分子荧光测序，其代表为美国Helicos公司的SMS技术和美国Pacific Biosciences公司的SMRT（single-molecule real-time）技术。另一类是纳米孔技术，代表公司为英国牛津纳米公司。虽然三代测序仪已经投入市场，但是三代测序技术的准确性仍然是一个问题。

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